细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法

细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  细菌赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过单肽化合物底物acetyl-Lys-pNA，受到赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解，释放出黄色对硝基苯胺，即采用比色法来测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种牙周炎细菌裂解萃取液、培养上清、牙周缝隙液体等样品赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

牙龈卟啉菌蛋白酶（gingipain）是一种胰蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase），常见于细菌表面、细胞外基质囊泡内以及细菌培养上清，为膜结合型和细胞外分泌型，有2个类型：精氨酸依赖特异性（arginine specific；Rgp）和赖氨酸依赖特异性（lysine specific；Kgp）。前者有2个同工酶：RgpA和RgpB：RgpA又分成HRgpA、RgpA（cat）和mtRgpA；RgpB又分成RgpB和mtRgpB。牙龈卟啉菌蛋白酶也是一种毒力因子，为革兰氏阴性厌氧细菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、等多种细菌生长提供营养，使血液凝结和纤维溶解（fibrinolytic）通路，以及免疫系统失调，激活激肽释放酶（kallikerin）和激肽（kinin）通路，调节宿主细胞因子网络，活化基质金属蛋白酶和血小板，切离层粘连蛋白（laminin）、纤连蛋白（fibronectin）、胶原蛋白等，间接促成牙周组织浸入和破坏，诱导细胞凋亡、CAM分子分解和细胞脱离（失巢凋亡anoikis），导致牙周病发生，甚至心血管疾病、风湿性关节炎和阿茨罕默症等。牙龈卟啉菌蛋白酶成为药物靶标。基于人工合成的单肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline；乙酰赖氨酰对硝基苯胺），受到赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的水解，释放出黄色对硝基苯胺（405nm 波长），来定量测定赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶的特异活性。赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶反应系统为：

产品内容

  裂解液（Reagent A）  毫升

  缓冲液（Reagent B）  毫升

  阴性液（Reagent C）    毫升

  底物液（Reagent D）    微升

产品说明书     1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品沉淀

培养箱：用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

• 样品制备

• 准备好500微升待测细菌（OD600＝0.8至1，即1至2 X 10⁷细菌/毫升）
• 转移到到1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新鲜的1.5毫升离心管——此为占85%细菌外分泌型酶蛋白
• 加入xx微升  裂解液（Reagent A），充分混匀
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里15分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管——此为占细菌内结合型酶蛋白
• 分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－   30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好上述制备的待测样品
• 设定好酶标仪（温度为37℃）：波长405nm
• 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  底物液（Reagent D）手心融化，避免光照

• 活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升  缓冲液（Reagent B）到相应孔里
• 分别加入xx微升  阴性液（Reagent C）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 分别加入xx微升  底物液（Reagent D）
• 轻轻摇动96孔板（注意：避免气泡）
• 在37℃温度下孵育30分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
• 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
• 活性计算：

• 酶标仪检测

• 比色皿检测

注意事项

• 本产品为21次（96孔板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，且避免反复冻融
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升；如果样本酶活性过低，即30分钟读数过低，则可以延长反应孵育时间至2小时；其次增加样本量（本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 赖氨酸牙龈卟啉菌蛋白酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.6条件下，每分钟内能够切离1微摩尔单肽化合物底物所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列牙龈卟啉菌蛋白酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感