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活体组织氧化应激活性氧(ROS)MitoSOX红色荧光测定试剂盒说明书
点击次数:495 发布时间:2021-03-10

活体组织氧化应激活性氧(ROSMitoSOX红色荧光测定试剂盒(超氧阴离子superoxide品说明书(中文版)

 

主要用途

 

活体组织氧化应激活性氧(ROSMitoSOX红色荧光测定试剂盒(超氧阴离子superoxide测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂MitoSOX,在线粒体氧化损伤条件下,产生红色荧光,来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成和增加的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌,即到即用,操作简易,活体检测,性能稳定。

 

技术背景

 

超氧自由基阴离子superoxide radicalO2-)、过氧化氢(hydrogen peroxideH2O2)、羟自由基或氢氧基hydroxyl radicalOH-)、过氧化基(peroxyl radicalROO-)、氢过氧自由基(hydroperoxylHOO)、烷氧自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric OxideNO-、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite anionONOO-次氯酸(hypochlorous acidHOCl)、半醌自由基semiquinone radical)、单线态氧气(singlet oxygen)等细胞内活性氧族(Reactive Oxygen SpeciesROS)的产生和增多,将导致细胞衰老或凋亡。其中线粒体氧化磷酸化副产物之一是超氧阴离子,为线粒体内主要的活性氧族,与心血管疾病,包括高血压、冠状动脉硬化、糖尿病相关的血管疾病、神经退行性疾病(巴金森氏症、阿茨罕默症、肌萎缩硬化症)相关。MitoSOX是一种完全自由通过细胞膜,并选择性活体细胞线粒体内长期滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化,便产生荧光。据此证明细胞线粒体超氧阴离子活性氧族的存在。

 

产品内容

 

  清理液(Reagent A    毫升

  染色液(Reagent B    微升

  稀释液(Reagent C    毫升

  保存液(Reagent D    毫升

产品说明书    1

 

保存方式

 

保存  染色液(Reagent B在-20冰箱里,严格避免光照;其余的保存在4冰箱里有效保证6

 

用户自备

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(GMS12024):用于细胞脱离

完全细胞培养液(GMS12052):用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管:用于细胞操作的容器

1.5毫升离心管:用于细胞染色的容器

培养箱:用于反应孵育

血细胞计数仪:用于细胞计数

台式离心机:用于样品操作

比色皿或96孔板:用于荧光定量分析的容器

细胞流式仪:用于细胞荧光分析

(共聚焦)荧光显微镜:用于观察荧光细胞

荧光分光光度仪或荧光酶标仪:用于细胞荧光定量分析

 

实验步骤

 

  • 间接法

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液(Reagent B置入冰槽里融化,  稀释液(Reagent C放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升  染色液(Reagent B到新的1.5毫升离心管,加入xx微升  稀释液(Reagent C,混匀后,标记为  染色工作液,置入暗室里。然后进行下列操作。

 

  • 准备125cm2细胞培养瓶的待测细胞
  • 小心抽去细胞培养液
  • 加入xx毫升   清理液(Reagent A到细胞培养瓶,覆盖培养瓶表面
  • 小心抽去  清理液(Reagent A
  • 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养平面
  • 置入37培养箱1分种
  • 振动培养瓶,使细胞脱落
  • 加入4毫升用户自备的完全细胞培养液
  • 移入15毫升锥形离心管,充分混匀(注意:悬浮细胞直接从这一步骤开始
  • 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
  • 移出1 X 106细胞到新的15毫升锥形离心管
  • 放入台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx毫升含有  染色液(Reagent B  稀释液(Reagent C  染色工作液,轻柔混匀
  • 放进37℃恒温水槽孵育20分钟,避免光照
  • 放入台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入预冷的xx微升  保存液(Reagent D,轻柔混匀细胞颗粒群
  • 放进冰槽里
  • 选择下列方式之一进行操作:
    • 即刻进行细胞流式仪分析:藻红蛋白phycoerythrinPE)波段观察50000个细胞以上――

波峰右移,表明超氧阴离子含量高

 

  • 或使用(共聚焦)荧光显微镜观察(定性检测):

1)移取10微升上述细胞悬液到载波片上,盖上盖玻片

2)激发波长510nm,散发波长580nm――

红色荧光增强,表明超氧阴离子含量高

 

  • 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测(定量检测):

1)移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2)加入xx微升  保存液(Reagent D

3)上下倾倒混匀数次

4)放进荧光分光光度仪:激发波长510nm,散发波长580nm――

RFU增高,表明超氧阴离子含量高

 

  • 直接法

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液(Reagent B置入冰槽里融化,  稀释液(Reagent C放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升  染色液(Reagent B到新的1.5毫升离心管,加入xx微升  稀释液(Reagent C,混匀后,标记为  染色工作液,置入暗室里。然后进行下列操作。

 

1.准备1个细胞培养24孔板的待测细胞,细胞铺满率达70

(注意:可以使用载玻片,载玻片培养皿,35mm培养皿,和其它培养孔板,见注意事项5

2.小心抽去细胞培养液

3.小心沿着孔壁加入xx微升含有  染色液(Reagent B  稀释液(Reagent C

  染色工作液1个细胞培养孔,覆盖培养孔表面

4.放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟

5.小心抽去含有  染色工作液 

6.小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的  保存液(Reagent D到细胞培养孔

7.选择下列方式之一进行操作:

A)使用倒置荧光显微镜观察(定性检测):

激发波长510nm,散发波长580nm――红色荧光增强,表明超氧阴离子含量高

 

  • 使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测(定量检测):

放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪:激发波长510nm,散发波长580nm――RFU增高,表明超氧阴离子含量高

 

注意事项

 

  • 本产品为20次(1毫升体系)或40次(0.5毫升体系)操作
  • 操作时,须戴手套
  • 孵育时,避免光照
  • 本产品适合各种规格的培养细胞:载玻片,载玻片培养皿,35mm培养皿,和各种培养孔板,须相应调整操作用量:

 

操作容器

操作用量

载玻片

100微升

载玻片培养皿

1毫升

35mm培养皿

1毫升

96孔培养板

100微升

48孔培养板

200微升

24孔培养板

500微升

12孔培养板

1毫升

6孔培养板

2毫升

25cm2细胞培养瓶

3毫升

 

  • 根据细胞类型,调整  染色工作液使用剂量(120011000容量比),避免过度染色
  • 建议细胞染色完成后,即刻进行细胞荧光分析
  • 本公司同时提供系列超氧阴离子活性氧检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定荧光清晰

 

 

电话
86-021-55825868
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