体液总抗氧化能力比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

MB10114.4 v.A

 体液总抗氧化能力比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 体液总抗氧化能力（TAC）比色法定量检测试剂是一种旨在通过过硫酸钾的参与，使染料ABTS氧化，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即抑制氧化等值浓度的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等各种体液的总抗氧化能力检测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过过硫酸钾（potassium persulfate）氧化2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）产生的ABTS自由基，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基或者消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪（730nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox对照。

产品内容

 缓冲液（Reagent A）      毫升

 染色液A（Reagent B1） 管

 染色液B（Reagent B2） 毫升

 氧化液（Reagent C）      毫升

 标准液（Reagent D）      微升

产品说明书 1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品存放和标准品配制的容器

4℃微型台式离心机：用于样品处理

96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色变化

实验步骤

• 样品准备

选择一：血浆样品

• 准备好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• 移取10微升上述制备的血浆到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent A），混匀
• 放在冰槽里待测

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管

• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• 移取10微升上述制备的血清到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent A），混匀
• 放在冰槽里待测

选择三：尿液/脑脊液/唾液/精液样品 

• 准备好1.5毫升离心管
• 移取1毫升液体到离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• 移取10微升到新的1.5毫升离心管
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent A），混匀
• 放在冰槽里待测

二、标准液准备

• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 移取xx微升 标准液（Reagent D）到1号管
• 小心移取xx微升 缓冲液（Reagent A）和xx微升 标准液（Reagent D）到2号管，混匀
• 小心移取xx微升 缓冲液（Reagent A）和xx微升 标准液（Reagent D）到3号管，混匀
• 小心移取xx微升 缓冲液（Reagent A）和xx微升 标准液（Reagent D）到4号管，混匀
• 小心移取xx微升 缓冲液（Reagent A）到5号管
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 样品测读

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化，移取xx毫升 染色液B（Reagent B2）到1管 染色液A（Reagent B1）里，混匀，置于暗室里室温下孵育过夜（16小时）后，标记为 染色工作液，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个96孔板，做好标记：空白对照孔、标准对照孔、样品孔
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent A）到96孔板里的每个孔里
• 分别加入xx微升 染色工作液  
• 分别加入xx微升 氧化液（Reagent C）
• 加入xx微升 缓冲液（Reagent A）到空白对照孔
• 加入xx微升上述配制的 标准液（Reagent D）到相应标准对照孔里
• 加入10微升体液样品到样品孔里
• 轻轻摇动96孔板，使其混匀
• 室温下孵育1分钟
• 即刻放进酶标仪里测读：730nm波长
• 分析结果：
  • 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD730nm）；横座标（X轴）为标准Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 空白对照孔为最大吸光单位（OD730nm）读数
  • 标准对照孔和样品孔为实际吸光单位（OD730nm）读数
  • 根据标准曲线获得样品对应Trolox浓度（微摩尔/升）
  • 计算样品实际总抗氧化能力

• 根据下列公式计算测定体系中样品量的总抗氧化能力（实际抑制百分率）

• IC50：50％抑制率所需的样品单位：TROLOX等值或样品蛋白浓度（毫克/毫升）或样品容量（微升）

注意事项

• 本产品为50次操作
• 本产品测试范围为高浓度30至150微摩尔
• 操作时，须戴手套
• 体液制备的所有操作均须在4℃状态下进行
• 测试前，样品须处于新鲜收集
• 样品须清澈
• 样品避免含有Tris、EDTA和还原剂等
• 空白对照孔的吸光读数应为2.0以上，如果低于1.5，不能用于高浓度检测，须增加 染色工作液的室温孵育时间
•  染色工作液避免反复在室温空气中久置。如果空白对照孔的吸光读数为3.5以上，建议使用无离子水稀释到2.5至3.0则可
• 样品读数越低，抗氧化能力越高
• 样本量不宜超过20微升
• 可以使用比色皿检测
• 如果样品抗氧化剂浓度过高或过低， 建议稀释或增加样品浓度
• 如果测试样品很多，建议使用排枪移液
• 如果用户没有730nm波长滤波器，可以使用640nm至810nm之间的任一波长替代；或者使用405nm波长替代
• 人体体液的总抗氧化能力在0.2至2毫摩尔标准水溶性生育酚Trolox的浓度
• 本公司提供低浓度测试试剂产品
• 本公司提供系列抗氧化分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感