石蜡切片P16蛋白免疫荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）

石蜡切片P16蛋白免疫荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  石蜡切片P16蛋白免疫荧光染色试剂是一种旨在使用标准化的化学分离石蜡方法和免疫荧光技术，即通过抗P16多克隆抗体以及荧光染料缀合物二抗，通过荧光显微镜分析存档中的石蜡包埋的组织切片中P16蛋白表达状况的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种动物和人体组织石蜡包埋切片中P16目标蛋白表达的荧光显微镜分析。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞周期因子依赖性激酶抑制剂2A（Cyclin－dependent kinase inhibitor－2A；CDKN2A，又称p16，抑制细胞周期因子依赖性激酶4和6，为肿瘤抑制因子，作用于细胞周期的调控。P16表达缺失，会导致肿瘤。免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种融合免疫学、生物化学和显微镜技术为一体的标记分析技术，通过使用抗体抗原反应和示踪荧光染料结合，定性和定位分析目标抗原蛋白分子。免疫荧光技术分为直接法和间接法：前者使用示踪荧光染料直接标记在特定抗体上，直接检测目标抗原；后者使用第一抗体先于抗原进行免疫反应，然后运用示踪荧光染料标记的第二抗体与第一抗原抗体复合物反应，又称为三明治方法，来检测目标抗原。石蜡切片免疫荧光染色，需要暴露组织抗原决定簇（epitope），便于抗体抗原充分反应。石蜡切片的制备过程中，甲醛固定产生交联，掩盖了抗原，通过酶消化处理，可以充分暴露组织细胞中的抗原部位。其次，在去垢剂通透处理后，使抗体容易接触到胞浆或细胞器的抗原。第三，借助山羊血清和牛血清白蛋白的作用，降低样品非特异性背景噪杂，显示反应的特异性。 

产品内容

  脱蜡液（Reagent A）                    300毫升（自备）

  补水液A（Reagent B）            100毫升

  补水液B（Reagent C）            100毫升

  补水液C（Reagent D）            100毫升

  补水液D（Reagent E）            100毫升

  清理液（Reagent F）                120毫升

  修复液（Reagent G）                  2毫升

  封阻液（Reagent H）                  4毫升

  一抗液（Reagent I）                  1毫升

  荧光液（Reagent J）                  1毫升

  抗淬灭液（Reagent K）               500微升

产品说明书                 1份

保存方式

保存  修复液（Reagent G）、  抗体液（Reagent I）、  荧光液（Reagent J）和  抗淬灭液（Reagent K）在—20℃冰箱里，严格避免反复冻融，其余的保存在4℃冰箱里；  荧光液（Reagent J）避免光照；有效保证3月

用户自备

盖玻片：用于封片孵育

小型染色缸：用于脱蜡的操作

烘箱：用于脱蜡处理

（共聚焦）荧光显微镜：用于组织细胞荧光观察

实验步骤

一、 脱蜡处理

1． 取出10片待测的10微米厚的石蜡包埋的组织切片 

2． （选择步骤）放进80℃烘箱，孵育30分钟

3． （选择步骤）室温下静置15分钟

4． 按下表依次放进小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的  补水液D（Reagent E）

6． 小心加上200微升  清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

7． 室温下孵育5分钟

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent F）

二、样品预处理

实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：

1． 加入200微升  修复液（Reagent G）在切片上，铺满整个切片样品表面

2． 室温下孵育5分钟

3． 小心抽去  修复液（Reagent G）

4． 空气中晾干

5． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

6． 室温下孵育5分钟

7． 小心抽去  清理液（Reagent F）

8． 加入200微升  封阻液（Reagent H）在切片上，铺满整个切片样品表面

9． 室温下孵育60分钟

10． 小心抽去  封阻液（Reagent H）

三、 样品染色处理

1． 加入100微升  一抗液（Reagent I）在切片上，铺满整个切片样品表面

2． 盖上盖玻片，室温下孵育1小时（注意：避免气泡；参见注意事项8）

3． 小心移去盖玻片，抽去一抗液

4． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

5． 室温下孵育5分钟

6． 小心抽去  清理液（Reagent F）

7． 重复实验步4至6二次

8． 加入100微升  荧光液（Reagent J）在切片上，铺满整个切片样品表面

9． 室温下孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）

10． 小心抽去荧光液 

11． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，铺满整个切片样品表面

12． 室温下孵育5分钟

13． 小心抽去  清理液（Reagent F）

14． 重复实验步11至13二次

15． 加入50微升  抗淬灭液（Reagent K）

16． 盖上盖玻片或封片

17． 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察：

注意事项

1． 本产品为10次操作

2． 操作时须戴手套，以防污染

3． 石蜡包埋前，组织切片须用10％甲醛4℃条件下，固定16小时，否则造成样品支离破碎

4． 所有操作在室温下进行

5． 用户可以使用二甲苯替代  脱蜡液（Reagent A）

6． 每次更换试剂溶液时，保持切片面基本晾干。空气中晾干状态为没有水滴，呈湿润状态，可见反光

7． 试剂溶液在切片表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满切片表面

8． 抗体孵育时，须避免光照

9． 一抗孵育，可以持续16小时

10． 建议染色完成后，即刻进行荧光显微镜观察 

11． 本公司提供系列P16蛋白免疫荧光检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰