脂类分子（lipids）薄层色谱（TLC）检测（Rhodamin B）试剂盒产品说明书

脂类分子（lipids）薄层色谱（TLC）检测（Rhodamin B）试剂盒产品说明书

主要用途

  脂类分子（lipids）薄层色谱（TLC）检测（Rhodamin B）试剂是一种旨在使用通过薄层硅胶基质材料上，使用特定的有机溶剂，使脂类分子移动而呈现分离状态，进而在罗丹明B的染色下，特异性地使脂类分子显示荧光，以分析样品中脂类分子状况的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物细胞和组织、植物组织，包括叶片（leaf）、谷粒（grain）、种子（seed）等样本脂类分子的色谱分析。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

脂类物质（LIPIDS）是一类脂溶性（疏水性）的自然分子，分为简单脂质包括脂肪酸（FATTY ACID）及其衍生物甘油一脂、二脂、三脂；复合脂质包括磷脂、糖脂、硫脂以及脂蛋白；和中性脂质包括甘油、固醇类（STEROL）物质，例如胆固醇。脂类物质在机体中具有能量储存的作用，是膜结构的组成成分和细胞信号分子。细胞浆脂滴（lipid droplet）的形成是正常细胞生理过程。脂滴由中性脂质构成，通常为甘油三酯，作为脂肪酸能量储备；或胆固醇酯（cholesteryl ester），作为过多细胞胆固醇的存储。薄层色谱（thin layer chromatography；TLC）是一种化合物和生物分子分离、识别、定量分析的常用方法，其分离鲜明、高度敏感、快速便捷、重复性好。通过薄层附着材料上，使用特定的有机溶剂，化合物分子移动而呈现分离状态。脂类分子通常采用吸附（adsorption）机制进行分离，为三种常用机制：吸附、间隔、逆向等之一。   

产品内容

  清理液（Reagent A）            毫升

  萃取液（Reagent B）            毫升

  稳定液（Reagent C）            微升

  层析液（Reagent D）                毫升

  荧光液（Reagent E）            毫升

  层析板              块

产品说明书               1份

保存方式

保存  稳定液（Reagent C）和  荧光液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；  萃取液（Reagent B）和  层析液（Reagent D）容易挥发，须密闭瓶盖；有效保证6月

用户自备

2毫升离心管：用于样品操作的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞或组织

4℃微型台式离心机：用于样品操作

玻璃器皿（或100毫升烧杯）：用于薄层层析

加热搅拌仪或烘箱：用于层析板干燥

长紫外或荧光成像仪：用于染色后观察分析

实验步骤

一、样品准备

1． 准备好10⁷细胞或200毫克组织等待测样品

2． 加入xx毫升  清理液（Reagent A）

3． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

4． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞或组织（约20至40下）

5． 将所有匀浆物移入到2毫升离心管

6． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1500g

7． 小心移出200微升上清液到另一个新的2毫升离心管

8． 加入xx毫升  萃取液（Reagent B）

9． 涡旋震荡10秒

10． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为5000g

11． 小心移出1毫升上层液相到另一个新的2毫升离心管

12． 加入xx微升  稳定液（Reagent C），混匀

13． 置于冰槽里备用（注意：可以容许挥发，浓缩样品）

二、薄层色谱层析

1． 准备一个玻璃器皿：参考尺寸为 5厘米（长） X5厘米（宽）X 8厘米（高）或100毫升烧杯

2． 倒入xx毫升  层析液（Reagent D）（注意：液面处于底部之上1厘米）

3． 盖紧玻璃器皿盖子备用

4． 取出一块  层析板

5． 置于加热搅拌仪的加热板上孵育3分钟

6． 室温下冷却

7． 分别加上1至2微升（0.2厘米直径）上述制备的样品在层析板上一端，距离底边1厘米以上（注意：可以并排加上4至5个样品）

8． 放进上述准备好的玻璃器皿里（注意：点样端朝下；  层析液（Reagent D）液面不能触及点样的样品）

9． 盖紧玻璃器皿盖子

10． 观察层析液在层析板上向上移动现象（10分钟左右），直至上沿距离层析板顶端0.5厘米处

11． 小心取出层析板

12． 置于加热搅拌仪的加热板上孵育3分钟，或直至层析液印迹消失

13． 室温下冷却

14． 将xx毫升  荧光液（Reagent E）倒入10cm玻璃培养皿里

15． 将层析板面朝下放进培养皿里浸泡数秒

16． 即刻置于暗室里晾干或置于加热搅拌仪的加热板上孵育30秒至1分钟（注意：肉眼可见发白的斑点）

17． 即刻放到长紫外成像仪（365nm）或荧光成像仪（激发/散发波长550/590nm）成像：

脂类分子阳性呈现黄色或紫蓝色斑点，背景为粉红色

18． 计算Rf值

【样品移动后斑点中心位置（厘米）—样品起始斑点中心位置（厘米）】÷【层析液移动后的终端位置（厘米）—层析液起始位置（厘米）】

注意事项

1． 本产品为10次（30至50个样品）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 所有操作通风柜里进行

4．   萃取液（Reagent B）和  层析液（Reagent D）容易挥发，须密闭瓶盖

5． 用户可以使用甘油三酯（triglycerides）、脂肪酸（fatty acids）、甘油二酯（diglycerides）、类固醇（steroids）、甘油一酯（monoglycerides） 等作为脂类分子标准品

6． 用户需要检测糖脂或磷脂。例如甾醇糖甙（sterol glycosides）、磷脂酸（phosphatidic acid）、单半乳糖甘油二酯（monogalactosyl glycerides）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol）、二半乳糖二甘油酯（digalactosyl glycerides）、脑硫脂（sulfolipid）、卵磷脂（phosphatidyl choline）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidyl ethanolamine）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidyl choline）、磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol）等，另购  特定层析液

7． 用户可以通过荧光强度分析脂类分子含量变化

8． 用户可以构建Rf层析移动图像或曲线 

9． 如果没有合适的荧光成像仪器，可以另购  特定显色液

10． 染色完成后，即刻进行成像仪观察

11． 参考图像如下：

12． 本公司提供系列薄层色谱检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰