冰冻切片组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位荧光染色

 冰冻切片组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位荧光染色检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

  冰冻切片组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位荧光染色检测试剂是一种旨在通过荧光染料甲酚紫标记的多肽底物作为探针，自由进入细胞内，受到组织蛋白酶B水解后，呈现荧光现象，以分析样品酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻组织内组织蛋白酶B的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

技术背景

组织蛋白酶（CATHEPSIN），是一种木瓜酶（papain）类半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶体细胞器内，在酸性环境下激活，切离各种目标蛋白。根据其结构和底物特异性，组织蛋白酶家属约有十多种成员，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。组织蛋白酶在细胞内蛋白和细胞外蛋白通过内吞进行周转中起着重要作用，同时也是启动和传递细胞凋亡信号的替代机制，以及肿瘤和炎症性组织损伤的病理生理变化。其中组织蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又称为CTSB，作为溶酶体的标志性酶蛋白，可以使β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein）转化为β-淀粉样蛋白斑点（β-amyloid plaque）在抗原处理（antigen processing）、肿瘤转移、骨再吸收、细胞内或分泌性调节蛋白周转、卵细胞成熟、细胞凋亡等方面具有重要作用。细胞间接触和细胞外基质成分影响43kd组织蛋白酶原L转化为成熟蛋白。组织蛋白酶B使胶原蛋白、结缔组织蛋白、β-淀粉样前体蛋白等降解。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反应。组织蛋白酶B异常，将导致阿茨罕默综合症（Alzheimer's disease）、食道肿瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。使用荧光标记的特异性底物可以探测组织蛋白酶B的特异活性。荧光染料甲酚紫（cresyl violet）上基团，通过酰胺（amide linkage）与人工合成的二肽化合物组织蛋白酶B底物RR（Arg-Arg；精氨酰精氨酰）双重替换后，受到组织蛋白酶B的水解后，释放出具有红色荧光的单一基团替换或无替换的甲酚紫，以此进行荧光（激发波长510至560nm，散发波长570至620nm波长）检测组织蛋白酶B的活性。

产品内容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀释液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

产品说明书               1份

保存方式

保存  染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）荧光显微镜：用于组织细胞荧光定性分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀释液（Reagent B）室温下预热。然后移出xx微升  染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升  稀释液（Reagent B），混匀后，室温下静置，并标记为  染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

1． 准备2片待测的厚为10微米的未经固着处理的冰冻切片（注意：建议使用异戊烷快速冷冻制片）

2． 置于室温下，小心加上xx微升预冷的  清理液（Reagent C），铺满整个切片表面

3． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

4． 小心加上xx微升室温预热的含有  染色液（Reagent A） 和  稀释液（Reagent B）的  染色工作液，铺满整个切片表面

5． 在37℃湿润培养箱里，孵育30至60分钟（注意：避免液体蒸发；可以盖上盖玻片孵育）

6． 小心移去切片上的  染色工作液，避免光照

7． 小心加上xx微升  清理液（Reagent C），铺满整个切片表面

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

9． 放上盖玻片或封片

10． 即刻在共聚焦或倒置荧光显微镜下进行观察 ：滤波器激发波长550nm，散发波长610nm ――如果红色荧光强度显著增强，表明组织蛋白酶B活性增强

注意事项

1． 本产品为20次（0.1毫升工作液）操作

2． 所有操作均须无菌状态下进行

3． 操作时，须戴手套

4． 建议使用正常组织切片作为阴性对照，显示微弱的背景信号

5． 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析

6． 用户可以使用510至560nm激发波长和570至620nm散发波长的任一波长进行检测

7． 用户可以使用赫斯特33342（Hoechst33342）进行复染，终浓度为1微克/毫升

8． 孵育时，必须避免光照

9． 本公司提供系列组织蛋白酶荧光染色分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰